Optimized method for extraction of exosomes from human primary muscle cells

International audienceSkeletal muscle is increasingly considered an endocrine organ secreting myokines and extracellular vesicles (exosomes and microvesicles), which can affect physiological changes with an impact on different pathological conditions, including regenerative processes, aging, and myopathies. Primary human myoblasts are an essential tool to study the muscle vesicle secretome. Since their differentiation in conditioned media does not induce any signs of cell death or cell stress, artefactual effects from those processes are unlikely. However, adult human primary myoblasts senesce in long-term tissue culture, so a major technical challenge is posed by the need to avoid artefactual effects resulting from pre-senescent changes. Since these cells should be studied within a strictly controlled pre-senescent division count (30 times fewer differentiated myoblasts than what is required for the ultracentrifugation method. In addition, exosomes could still be integrated into recipient cells such as human myotubes or iPSC-derived motor neurons. Modified polymer-based precipitation combined with extra washing steps optimizes exosome yield from a lower number of differentiated myoblasts and less conditioned medium, avoiding senescence and allowing the execution of multiple experiments without exhausting the proliferative capacity of the myoblasts

Identification of genes expressed in human cumulus cells according to oocyte nuclear maturity : effect of maturation conditions

Les cellules du cumulus (CCs) forment avec l'ovocyte le complexe ovocyte-cumulus (COC). Au cours de la folliculogénèse, un dialogue interdépendant régi par des jonctions communicantes se crée entre l'ovocyte et les CCs adjacentes. L'ovocyte en sécrétant certains facteurs, permettrait la différentiation et la prolifération des CCs qui, parallèlement, fournissent à l'ovocyte les nutriments nécessaires à sa maturation et son développement. La maturation nucléaire de l'ovocyte est définie par l'expulsion du 1er globule polaire au stade métaphase II (MII). Notre équipe a préalablement démontré que certains gènes exprimés dans les CCs chez l'humain, pouvaient prédire indirectement le potentiel implantatoire embryonnaire et la survenue d'une grossesse. Dans l'objectif d'identifier des marqueurs fiables de la maturité des ovocytes, nous avons analysé le profil transcriptomique des CCs en fonction du stade de maturité des ovocytes (VG, MI et MII). Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'impact des conditions de maturation in vivo versus in vitro, sur le profil d'expression de gènes des CCs en fonction du stade de maturation ovocytaire. Nous avons mis en évidence, pour la première fois, une signature spécifique dans les CCs associée à la maturité nucléaire des ovocytes in vivo et in vitro. Nous avons également observé une sous-expression des gènes impliqués dans la maturation ovocytaire et l'expansion des CCs, et une sur-expression des gènes associés au cycle cellulaire dans les CCs dérivées d'ovocytes maturés in vitro, comparées aux CCs issus d'ovocytes in vivo. En comparant l'expression des gènes dans les CCs selon la condition de maturation et le stade de maturité de l'ovocyte, nous avons identifié deux voies de signalisation dominantes : la voie des lipides (transport du cholestérol et des triglycérides) fortement activée en condition in vivo, et le processus de réplication, recombinaison et réparation d'ADN, spécifique aux CCs in vitro. Nos résultats montrent que les conditions de maturation des COCs ont un impact sur la signature moléculaire des CCs. De plus, La signature moléculaire identifiée dans les CCs à différents stades de maturation ovocytaire nous a permis de définir la compétence des CCs. En considérant ce critère, nous avons observé que les ovocytes matures associés à des cellules du cumulus compétents (sur-expression de la signature des CCs au stade MII) présentent un potentiel de formation de blastocyste supérieur aux ovocytes MII entourés des cellules du cumulus incompétents (sur-expression de la signature des CCs au stade VG et/ou MI). Ces résultats ouvrent ainsi de nouvelles perspectives en application clinique. Des études supplémentaires sont toutefois nécessaires afin d'identifier, dans un premier temps, les facteurs qui influencent l'expression des gènes au cours de la maturation ovocytaire in vivo et comprendre ainsi les voies de signalisation altérées par les conditions de culture in vitro.Cumulus cells (CCs) associated with the oocyte form the cumulus-oocyte complex (COC). During folliculogenesis, interdependent dialogue governed by gap junctions is created between the oocyte and adjacent CCs. The oocyte, by secreting certain factors allows the differentiation and proliferation of CCs which, at the same time, provide nutrients to the oocyte for its maturation and development. Nuclear maturation of oocytes is defined by its transition from germinal vesicle (GV) to metaphase I (MI) up to metaphase II (MII) phase. Our team previously shown that certain genes expressed in the human CCs could predict embryo and the pregnancy outcomes. We analyzed the transcriptomic profile of CCs according to oocyte nuclear maturation stages (GV, MI and MII). The aim of this study was to identify the CCs molecular signature according to nuclear maturation oocyte under in vivo and in vitro conditions. In addition, we studied the impact of culture conditions of the COCs under in vivo and in vitro on the gene expression profile of CCs. We have demonstrated that there is a specific signature in the human CCs associated with the nuclear maturity of human oocytes whatever the culture condition. We have also observed the under-expression of genes involved in oocyte maturation and CCs expansion, and the over-expression of genes associated with cell cycle function in the CCS derived from in vitro versus in vivo oocytes. By comparing gene expression in the CCs according to oocyte nuclear maturation stages, we have identified two dominant signaling pathways: the lipids pathway (cholesterol transport and triglyceride) strongly activated in in vivo conditions, and the process of replication, recombination and DNA repair, which appear to be specific to in vitro CCs. Our results suggest that the maturation conditions of COCs have an impact on the molecular signature of CCs.Moreover, our data showed that matures oocytes can be surrounded by competent (sur-expression of the identified molecular signature of CCs derived from oocyte at MII stage) or incompetent CCs (sur-expression of the identified molecular signature of CCs derived from oocyte at GV or/and MI stages). These results open new perspectives in clinical application.Further studies are needed to identify factors influencing gene expression during oocyte maturation in vivo. These data should help to better understand how/why signaling pathways are altered by culture conditions in vitro

Identification de gènes dans les cellules du cumulus selon la maturité nucléaire ovocytaire (influence des conditions de maturation)

Les cellules du cumulus (CCs) forment avec l'ovocyte le complexe ovocyte-cumulus (COC). Au cours de la folliculogénèse, un dialogue interdépendant régi par des jonctions communicantes se crée entre l'ovocyte et les CCs adjacentes. L'ovocyte en sécrétant certains facteurs, permettrait la différentiation et la prolifération des CCs qui, parallèlement, fournissent à l'ovocyte les nutriments nécessaires à sa maturation et son développement. La maturation nucléaire de l'ovocyte est définie par l'expulsion du 1er globule polaire au stade métaphase II (MII). Notre équipe a préalablement démontré que certains gènes exprimés dans les CCs chez l'humain, pouvaient prédire indirectement le potentiel implantatoire embryonnaire et la survenue d'une grossesse. Dans l'objectif d'identifier des marqueurs fiables de la maturité des ovocytes, nous avons analysé le profil transcriptomique des CCs en fonction du stade de maturité des ovocytes (VG, MI et MII). Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'impact des conditions de maturation in vivo versus in vitro, sur le profil d'expression de gènes des CCs en fonction du stade de maturation ovocytaire. Nous avons mis en évidence, pour la première fois, une signature spécifique dans les CCs associée à la maturité nucléaire des ovocytes in vivo et in vitro. Nous avons également observé une sous-expression des gènes impliqués dans la maturation ovocytaire et l'expansion des CCs, et une sur-expression des gènes associés au cycle cellulaire dans les CCs dérivées d'ovocytes maturés in vitro, comparées aux CCs issus d'ovocytes in vivo. En comparant l'expression des gènes dans les CCs selon la condition de maturation et le stade de maturité de l'ovocyte, nous avons identifié deux voies de signalisation dominantes : la voie des lipides (transport du cholestérol et des triglycérides) fortement activée en condition in vivo, et le processus de réplication, recombinaison et réparation d'ADN, spécifique aux CCs in vitro. Nos résultats montrent que les conditions de maturation des COCs ont un impact sur la signature moléculaire des CCs. De plus, La signature moléculaire identifiée dans les CCs à différents stades de maturation ovocytaire nous a permis de définir la compétence des CCs. En considérant ce critère, nous avons observé que les ovocytes matures associés à des cellules du cumulus compétents (sur-expression de la signature des CCs au stade MII) présentent un potentiel de formation de blastocyste supérieur aux ovocytes MII entourés des cellules du cumulus incompétents (sur-expression de la signature des CCs au stade VG et/ou MI). Ces résultats ouvrent ainsi de nouvelles perspectives en application clinique. Des études supplémentaires sont toutefois nécessaires afin d'identifier, dans un premier temps, les facteurs qui influencent l'expression des gènes au cours de la maturation ovocytaire in vivo et comprendre ainsi les voies de signalisation altérées par les conditions de culture in vitro.Cumulus cells (CCs) associated with the oocyte form the cumulus-oocyte complex (COC). During folliculogenesis, interdependent dialogue governed by gap junctions is created between the oocyte and adjacent CCs. The oocyte, by secreting certain factors allows the differentiation and proliferation of CCs which, at the same time, provide nutrients to the oocyte for its maturation and development. Nuclear maturation of oocytes is defined by its transition from germinal vesicle (GV) to metaphase I (MI) up to metaphase II (MII) phase. Our team previously shown that certain genes expressed in the human CCs could predict embryo and the pregnancy outcomes. We analyzed the transcriptomic profile of CCs according to oocyte nuclear maturation stages (GV, MI and MII). The aim of this study was to identify the CCs molecular signature according to nuclear maturation oocyte under in vivo and in vitro conditions. In addition, we studied the impact of culture conditions of the COCs under in vivo and in vitro on the gene expression profile of CCs. We have demonstrated that there is a specific signature in the human CCs associated with the nuclear maturity of human oocytes whatever the culture condition. We have also observed the under-expression of genes involved in oocyte maturation and CCs expansion, and the over-expression of genes associated with cell cycle function in the CCS derived from in vitro versus in vivo oocytes. By comparing gene expression in the CCs according to oocyte nuclear maturation stages, we have identified two dominant signaling pathways: the lipids pathway (cholesterol transport and triglyceride) strongly activated in in vivo conditions, and the process of replication, recombination and DNA repair, which appear to be specific to in vitro CCs. Our results suggest that the maturation conditions of COCs have an impact on the molecular signature of CCs.Moreover, our data showed that matures oocytes can be surrounded by competent (sur-expression of the identified molecular signature of CCs derived from oocyte at MII stage) or incompetent CCs (sur-expression of the identified molecular signature of CCs derived from oocyte at GV or/and MI stages). These results open new perspectives in clinical application.Further studies are needed to identify factors influencing gene expression during oocyte maturation in vivo. These data should help to better understand how/why signaling pathways are altered by culture conditions in vitro.MONTPELLIER-BU Médecine UPM (341722108) / SudocSudocFranceF